“细胞外囊泡”(EVs)是细胞自然释放的细胞衍生颗粒，与磷脂双分子层结合。EVs普遍存在于体液中，如血液和尿液。其特性包括细胞来源、浓度、组成和功能，均具有疾病依赖性。因此，科学界正积极探索EVs作为癌症和心血管疾病等疾病的生物标志物。然而，要将EVs有效应用于生物标志物，需要可靠且可重复的测量方法。目前，EVs生物标志物研究面临的主要挑战是不同仪器和单位之间测量结果的不一致性，这严重制约了多中心研究的开展，而多中心研究是临床生物标志物研究的关键。为提高数据的可比性，本研究开发了具有相似EVs物理性质的新型参考材料和参考程序。

这些新参考材料和参考程序的验证需要生物测试样品。我们开发了一种人血浆EVs测试样品（PEVTES），其特点包括：i) 类似于血浆中的亚细胞颗粒，ii) 现成使用，iii) 与流式细胞仪兼容，iv) 稳定性良好。为了制备PEVTES，我们采用了3例空腹供体血浆。我们使用血小板特异性（CD61）和红细胞特异性（CD235a）抗原或乳黏附素抗体对EVs进行免疫荧光染色，并通过大小排斥层析去除可溶性蛋白、脂蛋白以及未结合试剂。

分离后，我们使用08μm孔径聚碳酸酯过滤器去除残余血小板。PEVTES采用冷冻保存剂（如二甲亚砜DMSO、甘油或海藻糖）进行稀释，并在-80℃条件下保存12个月。解冻后，使用校准的纳米流式细胞仪（Apogee A60-Micro）测量染色的EV浓度。为了评估PEVTES的稳定性，我们对冷冻前以及在-80℃保存1、3、6和12个月后的样品进行了流式细胞仪测量，校准了流速、荧光信号和光散射信号。

根据测量结果显示，经过12个月保存的CD61+EVs的浓度在DMSO中降低了约33%，而在甘油和海藻糖中分别增加了9%和6%；CD235a+EVs的浓度在DMSO、甘油和海藻糖中的变化分别为降低70%、23%和15%。此外，乳酸粘附素+EV的浓度在DMSO中下降23%，在甘油中下降28%，在海藻糖中下降19%。这表明PEVTES在贮存期间具有良好的稳定性。

结论是，PEVTES在血浆EV检测中，具有以下优势：1) 与血浆中的亚细胞颗粒相似，2) 易于使用，3) 兼容纳米流式细胞术，4) 稳定性优秀。因此，PEVTES成为验证新开发的参考物和程序的理想候选物。

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