### 培养条件

在细胞培养过程中，建议使用的培养条件如下：

**气相比例**：95%空气与5%二氧化碳；**温度**：37℃。

### 传代方法

对于细胞传代，第一次建议以1:2的比例进行传代。传代后两天内请及时更换培养液。

**备注**：建议同时购买“尊龙凯时”品牌的相关细胞培养产品，享受非常优惠的价格。收到细胞后，在处理之前，应保持瓶盖未开启。请及时核查培养瓶上标注的细胞名称与实际订购是否一致，以及培养瓶是否存在破损或漏液等异常情况。

若未发现异常，使用显微镜观察细胞的生长情况，并对细胞拍照存档（可选择40x、100x、200x的放大倍数各一张）。特别注意前三天的照片是售后保障的重要依据，若未提供照片，将默认细胞状态良好。

### 贴壁细胞传代步骤

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。

2. 向培养瓶中加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，随后在显微镜下观察细胞的消化情况。若大部分细胞变圆并脱落，请迅速轻敲培养瓶并添加5ml以上完全培养基以终止消化。

3. 轻轻吹打细胞直至完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，于1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，再加入1-2ml的完全培养基进行重悬。

4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶传代（采用两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，并置入37℃、5% CO2的培养箱中继续培养。

### 悬浮细胞传代步骤

1. 采用半换液法，将培养瓶竖直静置于培养箱约1小时，然后轻轻吸去约3ml的培养基，并补充3ml的完全培养基。如果培养基颜色改变缓慢，可以直接添加约500ul的FBS。在传代时可直接补充5ml的培养基，分成两个培养瓶进行培养。一般建议传代3次后进行离心处理，以去除死细胞。

2. 离心换液法：若需分瓶，将细胞悬液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，再添加1-2ml的培养液后重悬，将细胞悬液按1:2的比例分入新T25瓶中，并按说明书要求配置新的完全培养基，以维持细胞的生长活力。后续传代可根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

### 细胞冻存和复苏

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，先弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，并在显微镜下观察，待细胞变圆后，加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打使细胞脱离，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；

3. 弃去上清，沉淀细胞并加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后放入冻存管中；

4. 将冻存细胞存放于-80℃冰箱中，若后期需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上。

### 注意事项

在运输过程中，部分细胞可能会因贴壁不牢而出现脱落现象，这属于正常情况。如脱落较多，应将培养瓶中的培养液收集至离心管，进行1000RPM的离心处理，收集上清以作过渡培养。然后，按照以上步骤进行处理与传代。

### 问题处理

1. **可重发的情况**：如细胞在运输过程中出现丢失、瓶身破损、培养液严重泄漏等问题，或在收到后的48小时内发现污染问题。需要真实实验结果进行核实后方可重发。

2. **不予重发的情况**：若细胞因客户操作不当或非推荐的细胞培养体系而影响状态，则不予重发。

通过以上详细步骤，借助“尊龙凯时”品牌的优质产品，我们致力于为您提供更优质的细胞培养体验。